1、加样：分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。空白孔加标准品&样品稀释液 50μL，余孔分别加标准品或待测样品 50μL，立即每孔加入配好的 Avidin-HRP 工作液 50μL（在使用前 15分钟内配制），注意不要有气泡，加样时将样品加于酶标板底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。给酶标板覆膜，37℃孵育 30 分钟。为保证实验结果有效性，每次实验请使用新的标准品溶液。
2、弃去孔内液体，甩干，洗板 5 次，每次浸泡 1-2 分钟，大约 350μL /每孔，甩干并在吸水纸上轻拍将孔内液体拍干。
3、每孔加底物溶液(TMB)90μL，酶标板加上覆膜 37℃避光孵育 15 分钟左右（根据实际显色情况酌情缩短或延长，但不可超过 30 分钟。当标准孔出现明显梯度时，即可终止）。
4、每孔加终止液 50μL，终止反应，此时蓝色立转黄色。终止液的加入顺序应尽量与底物液的加入顺序相同。
5、立即用酶标仪在 450nm 波长测量各孔的光密度（OD 值）。应提前打开酶标仪电源，预热仪器，设置好检测程序。
6、实验完毕后将未用完的试剂按规定的保存温度放回冰箱保存至有效期结束。
