1、加样。弃去孔内液体，甩干，洗板3次，每次浸泡1-2分钟，大约350μL /每孔，甩干并在吸水纸上轻拍将孔内液体拍干。
2、每孔加酶结合物工作液（临用前15分钟内配制）100μL，加上覆膜，37℃温育30分钟。弃去孔内液体，甩干，洗板5次，
3、每孔加底物溶液(TMB)90μL，酶标板加上覆膜37℃避光孵育15分钟左右（根据实际显色情况酌情缩短或延长，但不可超过30分钟。当标准孔出现明显梯度时，即可终止）。
4、每孔加终止液50μL，终止反应，此时蓝色立转黄色。终止液的加入顺序应尽量与底物溶液的加入顺序相同。立即用酶标仪在450nm波长测量各孔的光密度（OD值）。应提前打开酶标仪电源，预热仪器，设置好检测程序。
